Utstyr:

- Mikropipette, 5-100 mikroliter med flere spisser

- Begerglass

- Restriksjonsenzymer:

  · EcoRI(i rød beholder)

  · BamHI(i blå beholder)

  · HindIII(i grønn beholder)

- Lambda-DNA(fra influensa, ekstrahert vha. bakterier)

- Destillert vann

- Mikrosentrifugerør med lokk

- 6 Fargede mikrosentrifugerør, henholdsvis 2 røde, 2 blå, 2 grønne

- Fargetusj i sistnevnte farger

- Elektroforesekar

- Bufferløsning

- Strømkilde(9V batteri)

- Varmeskap m/ vannbad

- Karbonfiber

- Klipetenger

- Saks

- Markørfarge

- Hansker

 

Vi gjorde:

Alle steg beskrevet her ble gjentatt to ganger i fall feil skulle oppstå.

 

1)    Vi tilsatte 20 mikroliter destillert vann til rørene som inneholdt lambda-DNAet ved hjelp av pipetten. Vi ristet så forsiktig på rørene til det blå DNAet var løst tilnærmet homogent i vannet i ca. ett minutt. Vi lot så rørene stå i omtrent 5 minutter.

 

2)    Etter dette blandet vi de ulike enzymene med den nå vannløste DNA-prøven. Ved å bruke mikropipetten tilsatte vi 20 mikroliter lambda-DNA til henholdsvis et blått, rødt og grønt rør. Vi tilsatte også 20 mikroliter lambda-DNA til et enzymfritt rør. Vi fargela så lokket på seks av våre egne rør; to blå, to røde og to grønne for å overføre de ulike DNA-løsningene med samme fargekode til dem. Vi tok dessuten et syvende rør som vi ikke fargela. Vi brukte våre egne rør som var noe større enn de medfølgende, fargede sentrifugerørene av praktiske årsaker. Vi lot så rørene stå i omtrent fem minutter slik at de tørkede enzymene skulle få løse seg opp. I tillegg ristet vi forsiktig på rørene i ca. et minutt.

 

Vi passet på å bytte spiss på mikropipetten hver gang vi brukte den for å unngå uønsket forurensing av prøvene.

 

3)    Etter å ha klargjort prøvene, satte vi rørene ned i en isoporplate for så å plassere platen i et oppvarmet vannbad. Her lot vi rørene stå i 45 minutter for at enzymene skulle virke. Årsaken til at vi plasserte disse varmt i 45 min er at enzymene fungerer raskere ved økt temperatur. Etter å ha gjort dette, tilsatte vi 2 mikroliter markørfarge til samtlige prøver og blandet dette godt. Dette gjorde vi for å kunne observere selve ektroforesen tydeligere senere.

 

4)    Vi tok nå fram elektroforesekaret. Gelen i dette var en forhåndslaget løsning laget dagen før ved å varme opp 1g agarose i 100 mL TBE-buffer(svakt basisk). Vi tilsatte så en del flytende TBE-buffer i karet.

 

5)    Deretter klipte vi ut to biter av karbonfiberen og plasserte dem på innsiden av de smale kantene av karet som illustrert under(ved +/- elektrodene)

 

 

Det utklipte karbonfiberet fungerte altså som elektroder, der den negative polen utgjøres av de negative fosfationene i DNA-et, mens den positive er utgjort av

karbonkationer.

 

6)    Vi kunne nå applisere prøvene på gelen. Dette gjorde vi ved å bruke mikropipetten. Ved å kun trykke mikropipetten ned til første hakk oppnådde vi å påføre de ulike enyzmløste DNA-løsningene forsiktig ned i brønnene. Fordi vi tidligere hadde fargemarkert de ulike enzymene kunne vi nå skille mellom dem, og altså ha oversikt over hvilket enzym som virket i hvilken brønn. Vi noterte oss derfor i hvilken brønn vi overførte de ulike fargenemarkerte løsningene.

 

7)    Nå kunne vi koble til strømkilden. Dette gjorde vi som vist på figuren over ved å feste jerntenger festet til en ledning på hver av karbonelektrodene. Vi slo så på strømkilden og ventet på at DNA-bitene i de ulike brønnene skulle spre seg i ulik grad fra den negative til den positive elektroden. Fordi DNA-bitene var av ulik størrelse, møtte de ulik friksjon i gelen, og man kunne derfor se en tydelig strekmessig oppdeling av DNAet fra plusspolen til minuspolen. Årsaken til at bitene trekkes mot plusspolen er at DNA inneholder negative fosfatgrupper som for eksempel PO4-. Vi lot strømmen stå på helt til den blå markør-fargen i de ulike bitene nærmet seg plusspolen. Dette tok flere timer.

 

8)    Etter endt elektroforese helte læreren bufferen forsiktig av og tilsatte en fargeoppløsning(ca 10 mL). Læreren gjorde dette fordi vi ikke var til stede på skolen rett etter endt elektroforese, et ideelt tidspunkt å tilsette fargeoppløsningen på. Denne fargen skulle ligge på gelen i ca. 4 minutter for så å skylles bort. Gelen ble deretter vasket i 70% etanol i noen sekunder. Etanolen heltes så ut, og gelen ble skyllet forsiktig med vann 3-4 ganger. De fargede DNA-båndene skulle være ferdig farget etter ca. 30 minutter, men stod i vårt tilfelle i ca. 3 timer.

 

9)    Vi tegnet den ferdig ”fremkalte” gelen og DNA-bitene som nå hadde spredt seg(se vedlegg).

 

Resultat:

Etter endt forsøk kunne vi observere en nokså tydelig deling av DNA-båndene. De var ujevnt fordelt, men prøvene i de fire ulike brønnene hadde fordelt seg i tilnærmede firkanter mot plusspolen. Innenfor hver av disse "firkantene" kunne vi observere tydelige mønster og oppdelinger. Mens noe av stoffet fra brønnene bare lå som en homogen fargeløsning på gelen kunne vi også observere en tydelig strekdeling mellom DNA-båndene. Vi så også en tydelig oppdeling av båndene og altså nesten de karakteristiske DNA-strekene som man ideelt sett skal se. En slik oppdeling så vi kun tydelig der vi hadde brukt EcoRI og BamHI, noe som trolig ikke hadde sammenheng med enzymenes egenskaper, men med at vi trolig hadde for lite markørfarge i prøven som inneholdt HindIII-enzym. Vi kunne likevel skimte tre separate streker i løsningen der vi hadde brukt HindIII. Vi så altså en noe karakteristisk strekinndeling av DNA-båndene i alle prøvene der vi hadde tilsatt enzymer. Der det ikke var noe enzym tilsatt, observerte vi bare et sammenhengende bånd.  

 

Feilkilder

I dette forsøket kan det ha vært flere feilkilder som førte til at resultatet ikke var i fullstendig overenstemmelse med det i brosjyren. At vi ikke utførte forsøket i helt sterile omgivelser kan ha vært en av feilkildene. Selv om vi brukte hansker, kan DNA-prøven eller enzymene ha blitt forurenset av andre enzymer eller annet DNA. Dessuten opplevde noen problemer med mikropipetten; det var problematisk å måle opp så små mengder nøyaktig. Særlig når vi skulle tilsette helt ned mot 2 mikroliter fant vi det vanskelig å tilføre nøyaktige mengder. Dette førte i vårt tilfelle blant annet til at vi ikke fikk tilsatte like mye markørfarge til hver av prøvene, noe som igjen medførte at vi kun så vidt kunne skimte DNA-strekene fra den ene brønnen. Noen opplevde også å tilsette for mye markørfarge.

 

Konklusjon

Gelelektroforese kan i et skolelabratorium brukes til å skille ulike typer DNA-biter. I dette forsøket kunne vi tydelig skimte de ulike bitene og den karakteristiske strekdelingen mellom dem. Vårt forsøk inneholdt imidlertid trolig flere feilkilder, og det vil neppe være mulig å gjennomføre en nøyaktig elektroforese med det utstyret vi hadde tilgjengelig. Vi kan likevel konkludere med at forsøket virket omtrent slik som planlagt; lambda-DNA løst i ulike enzymer kan ved elektroforese danne et spesielt mønster som kan observeres ved framkalling av elektroforesegelen. På denne måten kan gjenkjenne spesielle kjennetegn ved DNA fra en spesiell organisme. Selv om våre resultater var omtrent som forventet og DNAet tydelig ble kuttet i strekformede biter, fikk vi ikke et resultat som liknet på det i brosjyren; vi kunne ikke ha brukt vårt forsøk til å kjenne igjen organismen som lambda-DNAet var tatt fra kun ved sammenligning av tidligere prøver.