Isolering av DNA hvitløk

Hovedhensikten med dette forsøket var å lære hvordan man kan hente ut og reinframstille (isolere) DNA fra kjernen i hvitløksceller. Samtidig lærte vi selvfølgelig litt generellt om DNA, og vi fikk mer håndfast og synlig kontakt med DNA.

 

 

DNA

DNA er en forkortelse for deoksyribonukleinsyre. I flercellede organismer finner vi som oftest DNA i cellekjernen, men vi finner også en mindre del i cellenes ”kraftstasjoner” som er mitokondrier og kloroplasteret hos plantene.

 

DNA molekylet er byggd opp av lange kjeder av nukleotider(se fig.1) Det er grunnen til at DNA kalles et polynukleotid. Hver nukleotid består av et sukkermolekyl (deoksyribose), et fosfatmolekyl og en nitrogenbase som kan være av fire ulike typer: adenin (A), guanin (G) som er puriner og cytosin (C), og tymin (T) som er pyrimidiner. Dette er altså ett DNA molekyl, men disse sitter ofte i par som en dobbel spiral, og dette er det man kaller et DNA molekyl. Disse molekylene sitter sammen med hydrogenbindinger mellom nitrogenbasene som sitter sammen slik: A til T, T til A, C til G og G til C. De to DNA trådene er med andre ord komplimentære.

 

Kromosomer

Et DNA- molekyl som er surret opp på mange små proteinkuler, kalles et kromosom. Vi har 46 kromosomer i hver av de vanlige cellene; 23 fra mor og 23 fra far. Når Vanligvis når cellene utfører sine vanlige oppgaver i kroppen og ikke deler seg, ligger arvestoffet som en stor klump av tråder i cellekjernen som kalles kromatin. Når cellene forbreder seg på celledeling surrer kromatinet seg opp på proteiner og blir til kromosomer.

 

Her er det illustrert:

DNA-molekylets oppbyggning. Deoksyribose (lyseblått) og fosfat (blålilla), er bundet sammen  

til to kjeder. Nitrogenbasene (A,T,G,C) er sammenbundet med hydrogenbindinger.

 

Kromosomene går sammen i kromosompar når celledeling pågår. Et kromosompar er to kromosomer som ”henger sammen”. Det er nemlig slik at genene ikke er tilfeldig spredd utover kromosomene. Hvert av de 23 kromosomene fra mor tilsvarer nemlig et av de 23 kromosomene fra mor. To kromosomer som tilsvarer hverandre inneholder gener som gir opphav til de samme egenskapene. (Gener som koder for den samme egenskapen kaller vi homologe) Disse egenskapene trenger ikke være helt like, og det ene kromosomet kan ha gener som koder for blå øyne og det andre kromosomet har gener som koder for brune. Det finnes altså mange varianter av egenskapen.

 

Et av de 46 kromosomparene i hver celle er såkallte kjønnskromosomer. Genene i disse kromosomene bærer på informasjon som avgjør om vi utvikler gutt eller jentekropper. Kjønnskromosomene forekommer i X og Y kromosomer. Hvis jeg ikke husker feil er Y kromosomet lite og X kromosomet stort. Kjønnskromosomet i en eggcelle er alltid av typen X, mens Kjønnskromosomet i en spermie kan være av typen X eller Y. Hvis en eggcelle (X) smelter sammen med en spermie (X) vil det gi opphav til en jente, og hvis en eggcelle smelter sammen med en sædcelle (Y) vil det gi opphav til en gutt.

 

 

 

Kromosom: Her ser vi et kromosom, sannsynligvis igjennom et lysmikroskop. Kromosomene ser slik ut når de deler seg. Dett viser sannsynligvis kromosomet i pro-fasen som jeg nevner under ”vanlig celledeling”. Dette bildet viser to kromosomkopier, og DNA- molekylet som vi ser i den venstre kopien, er identisk med den i den høyre kopien. DNA- molekylet er i virkeligheten svært fortettet i et kromosom, så helt korrekt er det ikke. Hva de solbrilleaktige greien på midten er, vet jeg ikke.

 

Hos mennesket finner vi 46 slike kromosomer i alle cellene unntatt kjønnscellene som inneholder 23. Dette er for å unngå å fordoble antall kromosomer når eggcellen smelter sammen med sædcellen. For å redusere  antallet til 23 kromosomer må kjønnscellen gjennomgå en reduksjonsdeling eller meiose som det også kalles. Ved reduskjonsdeling dannes det nemlig nye celler som inneholder halvparten så mange kromosomer som den cellen man startet med.

 

Kopiering av DNA-molekylet (replikasjon)

Før hver celledeling kopieres DNA – molekylene slik at dattercellene DNA er identisk med morcellens. Prosessen foregår slik:

 

Først angriper et enzym de svake bindingene mellom nitrogenbasene i DNA-molekylet som skal kopieres. Slik blir Dna-molekylet splittet. Så lages nye kopier av hver tråd av DNA polymerase. Nå har vi to helt like DNA- tråder.

(se fig 2.)

 

Celledeling:

Vanlig celledeling, mitose, fører til to nye celler med samme antall kromosomer. Mitose er helt nødvendig for at organismen skal vokse og for å erstatte ødelagte celler. Her ser vi prosessen der begynnelsesfasen er bedre forklart enn den i boka:

 

Vanlig celledeling (mitose): (bruker ett kromosompar som eksempel. Dette skjer med alle de 23 kromosomparene)

 

1. Mellomfasen:

Her ser vi en vanlig celle som ikke deler seg og er i ”jobb fasen”. Arvestoffet ser ut som en uklar masse som kalles kromatin

 

2. Pro- fasen

Nå forbreder cellen seg på deling. Cellekjernen blir borte, og kromatinet organiseres i 46 kromosomer.

Arvestoffet i en celle, det vil si DNA molekylene, har til sammen en lengde på 2,16 m. For å unngå fullstendig kaos, kveiler DNA- molekylene seg opp til kromosomer. Kromosomene kommer til syne som kromosompar. Informasjonen fra disse DNA- molekylene avleses, og dermed ikke utføre sin oppgave. Derfor kveiler DNA-et seg kun opp til kromosomer når celledeling forekommer. Det ene kromosomet inneholder arvestoff fra moren, og det andre fra faren. Disse arvestoffene er litt forskjellige (se over).

 

Så lager hvert kromosom i kromosomparet en kopi av seg selv, fordi det trengs en kopi til hver av de to nye cellene som lages. Veggene rundt cellekjernen forsvinner nå og kromosom paret henger sammen på midten i en kobling som kalles centronomer.

 

3. Meta- fasen

Nå kommer det tynne tråder ut fra to knytepunkter i celleveggen som kalles centrioler. Disse trådene hekter seg fast i kromosom parene.

 

4. Ana-fasen

Trådene trekker hver kromosomkopi til hver sitt knytepunkt i celleveggen. Vi har nå to like kromosompar.

 

5. Telo-fasen

Cellen deler seg i to nye celler og det dannes en kjernemembran i hver av cellene.

 

Nå har vi to nye celler med hver sin kopi av arvestoffet i kromosomene, og kromosomene oppløses og vi får igjen de trådlignende strukturene som kalles kromatin . Celledelingen er ferdig og cellene fortsetter med oppgaven sin

 

Når jeg er igang kan jeg like gjerne beskrive meiosen også:

 

Reduksjonsdeling (meiose)

Punkt 1 er identisk med mitosen, men på slutten av fase 2, Pro- fasen, skjer noe annet:

 

Pro-fase:

Når kromosomparet er blitt kopiert og cellemembranen er borte går de to kromosomparene sammen i en gruppe på fire (2X2 kopier). Dette kalles en tetrade.

 

 

 

Når kromosom-paret sitter i tetrader forekommer det noen ganger at biter av morens arvestoff mot biter av farens arvestoff. Dette skaper en større genetisk variasjon på godt og vondt vil jeg tro. Dette er en mutasjon som kalles overkrysning.

 

3. Meta-fase 1:

Nå ligger tetraden midt i cellen og trådene hekter seg fast i kromosomene, slik som ved mitose.

 

4. Ana-fase 1

<bilde>

 

 

 

 

 

 

Nå trekkes kromosomen mot hver centriole i cellen. Det er tilfeldig hvilken side mamma- og pappakromosomet går. På den måten blir arvestoffet blandet.

 

5. Telo-fase 1

<bilde>

 

 

 

 

 

I denne fasen snøres cellen av på midten og danner to celler. Etterhvert dannes også en kjernemembran.

6. Pro-fase 2

<bilde>

 

 

 

 

Nå har vi fått to celler. Hvert kromosom i den ene cellen inneholder arvestoff bare fra mor, og den andre bare fra far med unntak av den lille biten som noen ganger blir byttet ut i pro-fase 1.  Videre følger vi kun det ene kromosomet.

 

7. Meta-fase 2

<bilde>

 

 

 

 

 

 

Nå fester det seg tråder i kromosomet enda en gang.

 

8. Ana-fase 2

<bilde>

 

 

 

 

 

 

 

Nå trekkes hver kromosomkopi (kromatid) til hver sin side av cellen.

 

9. Telo-fase 2

<bilde>

 

 

 

 

 

Nå snøres cellen av på midten og etterhvert dannes kjernemembranen igjen.

 

Dette blir da resultatet av kromosomparets (!) meiose:

 

Hos mannen blir hver av disse cellene til sædceller, mens det hos kvinnen kun er en som blir til eggcelle. De tre andre cellene får andre oppgaver. Hver celle har kun en av hvert kromosom og kalles kjønnscelle. Meiosen er ferdig!

 

Gener

Et gen er en bestemt, avgrenset rekkefølge av nitrogenbaser i et DNA- molekyl. Et gen blir til et protein hvis jeg har forstått det riktig. Denne rekkefølgen er på en måte en kode som beskriver hvordan det spesifikke proteinet skal bygges opp av aminosyrer. Tre baser i rekkefølge danner en bostav Det er genene som bærer på all den arvelige innformasjonen; om vi er gutt eller jente, om vi har løs eller fast øreflipp osv.

 

Slik skapes et protein ut ifra informasjonen fra et gen:

Først leter et spesielt enzym etter en spesiell kode i DNA molekylet som forteller at her starter et bestemt gen. Så må DNA- molekylet folde seg ut slik at den doble helixen (spiralen) blir synlig. Så splittes den dobble helixen av det samme enzymet slik at basene som sitter i bestemte rekkefølger blir åpne for avlesning.  DNA er for stort til å trenge seg ut av cellekjernen. Problemet løses ved at DNA lager en kopi av seg selv: RNA.

 

RNA er små DNA liknende komponenter som har den fordelen at de kan komme seg ut av cellekjernen, noe som kreves for å kunne produsere proteiner. Det er noen vesentlige forskjeller på DNA og RNA: RNA har blant annet en annen sukkerkomponent (ribose) enn DNA, forekommer vanligvis ikke i dobbelspiral og nitrogenbasen tymin er byttet ut med basen urasil. (se fig 1.) RNA fester seg til basene på  samme måte som den komplementære (den originale tilhørende DNA tråden) DNA tråden gjør.

 

Hvis vi sier vi har en oppskrift på et protein som der slik ut(tatt fra nettside): TACCCGTTACCTAGCCGTTAAATT. Da vil dette bli lest av og bli til en RNA- tråd som ser slik ut: AUGGGCAAUGGATCGGCAAUUUAA. Dette er RNA tråden som inneholder opplysningene om hvordan proteinet skal settes sammen. En slik tråd blir kalt mRNA (messenger= budbringer) Denne mRNA tråden fraktes ut av cellekjernen og ut i cytoplasmaet der det finnes aminosyrer å bygge proteiner av. mRNA’et legger seg så oppå et ribosom der selve proteinproduksjonen foregår. Disse ribosomene dannes av rRNA, noe som ikke stod i naturfagsboka.Her frakter en annen type RNA, tRNA (transport) aminosyrer bort til ribosomet etterhvert som de trengs.

 

tRNA er et lite molekyl med tre nitrogenbaser i den ene enden og en aminosyre i den andre. Hvilken aminosyre som finnes i den andre enden bestemmes av de tre basene.

 

Det som skjer nå er at når de tre første nitrogenbasene på mRNA molekylet legger seg oppå ribosomet, tiltrekkes et tRNA molekyl som har koden som passer. Derfor kan man si at 3 nitrogenbaser utgjør en kode eller ord.

Så glir mRNA- molekylet videre slik at den neste koden (3 nitrogenbaser) kan tolkes. Koden som var satt som eksempel på den ene nettsiden tolkes da slik:

Ribosomet leser av basene i RNA-tråden tre og tre, og vi får denne koden:
RNA-baser	AUG	GGC	AAU	GGA	UCG	GCA	AUU	UAA
betydning	start	Glycin	Asparagin	Leucin	Serin	Alanin	Isoleucin	stopp

 

 Slik fortsetter det helt til mRNA- molekylet har glidd over ribosomet. All tRNA- molekylene frakter med seg en aminosyre og disse bindes sammen til tråder.

 

 

 

Mutasjoner

Mutasjon betyr ”endringer i DNA- molekylet”. Mutasjoner er både hyppige og konstante og det er mutasjoner som har ført til at nye arter har oppstått.

 

Punktmutasjoner regnes som den vanligste mutasjonstypen. Punktmutasjoner kan forklares som en feil ved DNA-kopieringen i forbindelse med celledeling. Det som skjer er at en nitrogenbasen enten kan falle bort eller komme til. Fordi kodene leses tre og tre fører dette til store endringer.

 

En annen type mutasjon er det som kalles overkryssning. Dette har jeg vist under meiosen under pro- fasen.

 

Hvorfor utvinner vi DNA?

Dna er nøkkelen til å løse mange problemer nå, og i fremtiden. En av områdene DNA brukes hyppigest er under identifisering og for å påvise slektskap.

 

Det mest vanlig bruksområdet for DNA- tester i sivile saker, er farskapstester i familiesaker. Man kan også bruke det til å bekrefte/avkrefte andre ting i slekten, eller om man kanskje mistenker utroskap. En farskapstest er en test for å finne om faren virkelig er faren. Man tar da for eksempel en spytt/hudcelleprøve fra munnen til faren og sammenligner DNA’et derifra med barnets DNA. Det som er lite kjent, er at man også kan bruke slektningers DNA for å påvise et farskap eller slektskap.

 

DNA kan også brukes i rettsmedisinske sammenhenger, altså i kriminalsaker. Arvestoffet vårt er nemlig blitt et svært viktig verktøy når forbrytelse etterforskes av politiet. Man kan sammenligne DNA fra for eksempel hårstrå, blod, sæd eller hudceller fra åstedet og så sammenligne med DNA fra mistenkte. Personer som dømmes for alvorlige forbrytelser, får DNA-profilen sin i politiets DNA-register. Problemet med dette registeret er at svært få av de som begår slike alvorlige forbrytelser har gjort det før. Derfor har det vært snakk om å utvide DNA-registeret, og noen mener til og med at man burde registrere hele befolkningen, slik at man raskt får tatt den/de skyldige ikke bare i store, men også små saker. De som begår alvorlige forbrytelser har nemlig ofte begått mindre alvorlige før. DNA- kan også brukes for å avdekke identiteten til lik. Hvis liket er ugjennkjennelig pga. for eksempel mishandling er dette et godt hjelpemiddel.

 

Ved å kartelgge arvestoffet finner vi egenskapene til individet. I fremtiden kan kanskje ved å lese genene, helbrede sykdommer og kanskje også hvilke sykdommer som vil kunne intreffe. Man kan kanskje også kurere arvelige sykdommer.

 

Kloning kan vel også bli mer brukbart i fremtiden for å skape en perfekt skapning. Sauen Dolly var det første dyret som ble klonet.

 

DNA utvinning er også nødvendig for å kunne produsere genmanipulert mat/grønsaker. Denne genmanipulerte maten kan kanskje være et viktig middel i kampen mot fattigdom og sult. Likevel vites det ikke nok om genmanipulert mat idag. Et genmanipulert kostilskudd som er tilgjengelig i USA kan visstnok kobles til sykdomsepedemien EMS som førte til 37 døde og 1500 med varige skader. Den genmanipulerte tomaten Flavr Savr skal også ha gitt skader på magene til forsøksdyr. Genmanipulert mat er ikke godkjent for salg i Norge.

 

Dette er en tomat fra såkalte FLAVR SAVR frø.

 

Rapport

 

Utstyr:

-       Begerglass

-       Isopropanol

-       3 hvitløksfedd

-       1,5g Salt, 5g natron, 1,2 dl sterilt vann, en teskjed shampo(=Buffer)

-       Kaffefilter

-       Glasspinne

-       Dråpeteller

-       Hvitløkspresse

-       Isbiter

 

Fremgangsmåte:

1.   Isopropanolen skal kjøles ned i en fryser. Dette hadde læreren gjort på forhånd.

2.   Først blandet vi natron, salt, vann og shampo sammen til buffer og la den i et større beger med vann med isbiter for å avkjøle blandingen. Bufferen motvirker store pH endringer i vannet.

3.   Så moste vi hvitløken med hvitløkspressen, la moset i et begerglass med 1 teskjed vann og rørte mosen til den var jevn og glatt. Vi hadde da knust celleveggene, og cellinnholdet hadde lekket ut av cellene.

4.   Deretter overførte vi 3 teskjeder av hvitløken til bufferen og rørte kraftig i ca. 2 min. Såpen i bufferen løser opp fettet i cellene og å få proteinene til å klumpe seg sammen, mens DNA-moleylene flyter løst i bufferen.

5.   Så helte vi blandingen ned i kaffefilteret og filtrerte det over i et annet glass. Celleveggene, og proteinene ble da sittende igjen i filteret, mens DNA- molekylene, som flyter løst rundt i bufferen, seilte igjennom filteret.

6.   Så tilsatte vi 10 ml iskald isopropanol, som vi målte opp med dråpetelleren, i bufferen som nå inneholder små usynlige DNA-molekyler. Isopropanolen skal skille DNA-molekylene fra vannmolekylene i blandingen. Når dna molekylene ikke er omgitt av vann lenger, klumper de seg sammen. Deretter tvinner de seg sammen til en ”megatråd” som er så stor at vi kan se den.

7.   Til slutt rørte vi rolig i ca. 1. min og løftet glasspinnen sakte opp. Det var da meningen at det skulle følge med en slimklump på glasspinnen, men vi så dessverre ingenting på vår. Vi studerte istedenfor en annen gruppes glasspinne hvor slimklumpen var synlig. Slimklumpen var en floke av DNA-tråder. Denne floken inneholder hele oppskriften til hvitløken jeg startet med.

 

Konklusjon:

I dette forsøket lærte jeg hvordan man skiller ut arvematerialet fra cellekjernene i hvitløk. Dette arvematerialet er veldig smått, men siden det samlet seg tusenvis av slike DNA- tråder, kunne vi se dem som en slimklump. Dette er altså ikke kromosomer, men løse DNA tråder slik de ligger i cellekjernen når cellen utfører sine vanlige oppgaver i kroppen (kromatin). DNA trådene som vi faktisk kunne se i dette forsøket, noe som ellers kun er mulig i elektronmikroskop, se DNA trådene, men kun fordi det var så mange av dem. Hver og en av disse trådene inneholder oppskriften (genene) for alle proteinene i kroppen. Det er rekkefølgen på nitrogenbasene som danner kodene for å lage et protein. Tre nitrogenbaser i rekkefølge danner en ”kodeord”, og med 4 nitrogenbaser gir dette 64 ”kodeord”. Hver av de 20 aminosyrene i kroppen har vært sitt kodeord (noen har flere). Et gen inneholder de kodeordene som gir informasjon om hvordan proteinet skal bygges opp av aminosyrer. Et gen inneholder altså flere kodeord. Så kopieres og fraktes denne informasjonen av RNA, ut til ribosomene i cytoplasmaet. Her bygges proteinet. Jeg synes dette er et ufattelig system. Utrolig at det fungerer, med unntak av noen tilfeller. Det blir mer interresant jo mer avansert det er synes jeg. Det eneste problemet mitt var at det faktisk kunne stå litt forskjellige ting på de forskjellige sidene, noe som gjorde meg litt forvirret.

 

Kilder:

www.forskning.no

www.wikipedia.org

www.okokrim.no

Naturfagbøkene

 

Fig 1.

 

FIG 2.